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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化修饰语组学、LC-MS/MS磷碱化位点讲解技术服务。
英文音标版头：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文名一级标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
大家的单位：山东大学
研究方案物料：拟南芥侧根
拜谱作为技术设备：磷酸性反应遮盖组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点讲解
探索理念：
PART 01 研发毕竟
01、种子发芽素驱动VIK的磷酸性反应下列关于转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用球氨基酸混合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 的生长素加快VIK的磷碱化还有转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化工作。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酒曲双改良品种分折（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补式激光散斑科学试验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且体内磷酸性反应实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时时间定量分析PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素数字信号关键调整 LR 发育成熟
使用解析俩个VIK T-DNA插入表格遗传染色体染色体变动的体（vik-2和vik-3），知道与野外型相比较，遗传染色体染色体变动的体的LR溶解度计算、LR原基（LRP）和已发肓的的LR有明显限制，更是是vik-2（图2）。相左，过得出结论VIK的转遗传染色体主茎展现出LR溶解度计算加强。还有，在vik-2遗传染色体染色体变动的体历史背景下得出结论VIK的转遗传染色体主茎医治了LR发肓的一些缺陷。发肓的素工作测试得出结论，vik-2遗传染色体染色体变动的体对发肓的素诱导型的LR发肓的发应削弱，得出结论VIK在发肓的素调整LR发肓的中挥发关键点意义。 
图2 VIK介导的发芽素卫星信号通道领域政策调控LR的大
03、VIK 与ERF13 实行物理性相互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双团伙荧光互补性 （BiFC）和免疫系统共悠长岁月中进行实验（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13完美的作用
04、VIK以正负极馈的的方式调节ERF13磷酸性反应
通过磷过酸淀粉酶组学解析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点基因突变表明显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反面馈方法磷硝化作用ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷硝化作用有利于ERF13生物降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体测试和肚子里测试，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟系统和磷酸解离基因突变体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚受损细胞标记浅析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷硝化作用速度了ERF13生物降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化调高 LR 的出来
论述进两步论述了VIK干预的ERF13分解在侧根（LR）成长发育中的功效。确认较为各种的不同转什么是基因植被系的LR表型，发觉过展示ERF13调节了LR的显示，在vik突变的体中这样调节功效不断增强，而在过展示YFP-VIK的时代背景下这样调节功效减少（图6）。然而，较为ERF13的各种的不同磷硝化作用模拟仿真系统和磷酸解离基因变异体的过展示植被系，发觉ERF132A-Myc（磷酸解离）的植被系LR显示比较少，而ERF132D-Myc（磷硝化作用模拟仿真系统）的植被系LR显示略多。以上然而说明，VIK介导的ERF13磷硝化作用和分解催进了LR的显示。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸力促LR的出现了
07、VIK在侧根发肓中磷碱化并安稳LBD18核蛋白
经由概述这两个VIK T-DNA嵌入突然变化体（vik-2和vik-3），感觉与野生植物型想必，突然变化体的侧根（LR）密度计算公式计算、LR原基（LRP）和已成长的LR偏态减小，特别的是vik-2（图7）。相等，过展示VIK的转表观遗传植物体表現出LR密度计算公式计算曾加。因此，在vik-2突然变化体后台下展示VIK的转表观遗传植物体复原了LR成长缺点。出现素除理测试阐明，vik-2突然变化体对出现素诱发的LR成长生理反应减少，阐明VIK在出现素控制LR成长中起到的关键功效。 
图7 VIK 在LR进行整个过程中就直接磷碱化和稳固LBD18球蛋白
PART 02 文章标题个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用氨基酸质组学了解筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的滋生素走势控制侧根行成
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的血清质组学、淡化血清质组学、分泌组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超低宽度DIA·磷过酸表达组，采用创新生物富集技木+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现猎物样品10w+、观赏植物样品5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
基准医学文献：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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